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技術專欄

ELISA實驗室常見問題及原因分析

供稿：技術部

發布時間：2022-05-04

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高背景/非特異性染色

結果描述 ?	可能的原因	建議及預防措施
終止后,整板結果顯現均一的黃色或淡色;或標曲有線性但背景過高	整版發黃現象可能由于錯加其他試劑造成	實驗前檢查試劑的組分及批號,確認所有組分均屬于對應的試劑盒.不同試劑盒或不同批號
	未充分清洗酶標板	確保清洗過程中每個微孔所加入洗滌液量一致.清洗完成后,將酶標板用力按壓在吸水紙上,以除去殘余的緩沖液.
	孵育時間過長	請嚴格按照說明書步驟操作
	酶標記物污染了吸頭及盛放顯色劑容器或陽性對照污染了微孔	吸取不同的試劑時應更換吸頭,配置不同的試劑組分時,應使用不同的儲存器皿,操作時請使用移液器
	檢測抗體貨Avidin-HRP的濃度過高	檢查濃度計算是否正確或進一步稀釋后再使用
	底物在使用前曝光或污染	加入底物前,應始終避光保存
	顯色時間過長	請嚴格按照說明書步驟操作
	讀取了吸光值時使用了錯誤的濾光片	TMB為底物時應在450nm波長讀取吸光值,并以650nm作為校正波長

白板

結果描述 ?	可能的原因	建議及預防措施
顯色步驟結束后,酶標板所有孔均無顏色;陽性對照不明顯	組分試劑混淆使用	配制或使用時應看清楚標簽
	洗版及加樣過程中,酶標物受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力	確認盛酶標的容器不含酶抑制劑(如NaN3等),確認配制洗液的容器已洗干凈.
	遺漏了某種試劑或某個步驟	詳細審閱說明書,并嚴格遵循操作步驟

顯色淡

結果描述 ?	可能的原因	建議及預防措施
包括標曲、樣本在內的所有板孔顏色均較淡	試劑盒超過有效期或儲存不當	請在有效期內使用,并按照說明書推薦的保存條件保存,避免污染
	試劑、樣品用前未平衡	所有試劑、樣品應置室溫平衡30min左右
	移液器吸量不足,移液抽吸排放太快,吸頭內壁掛液太多或內壁不清潔	校正移液器,吸頭要配套,每次吸頭要吻合緊密,移液不宜過快,排放應完全.吸頭內壁要清潔,最好一次性使用.
	孵育反應時間不足	定時器準確定時
	顯色反應不足	一般在15-30min
	洗滌次數增加,濃縮洗液稀釋倍數不符合要求	減少洗滌沖擊力,按照說明書要求稀釋濃縮洗液、洗滌時間,準確記錄洗滌次數及用量
	蒸餾水水質有問題	配置好的洗液一定要檢測PH值是否呈中性
	洗板及加樣過程中,酶標物受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力	確認盛酶標的容器不含酶抑制劑(如NaN3等),確認配制洗液的容器已經洗干凈,確認配置洗液的純化水達到要求且未受污染.
標曲正常,樣本顯色較淡	樣本使用NaN3防腐劑,抑制了酶的反應	樣本不可使用NaN3
?	待測樣本中可能不含強陽性標本,故結果可能是正常的	如有懷疑,可以復檢
目測結果正常,但酶標儀讀值偏低	讀取吸光值時使用了錯誤的濾光片	TMB為底物時應在450nm波長讀取吸光值,并以650nm作為校正波長

標準曲線不佳/重復性不好

結果描述 ?	可能的原因	建議及預防措施
重復性差	標準品配制有誤	嚴格按照說明書標準品配制進行操作,僅使用推薦的稀釋液對標準品進行稀釋
	試劑盒儲存方法不當或儲存環境太差	請在說明書推薦的條件下保存,不要將重懸后的組分在室溫放置時間過長
	過早稀釋各工作組分	各工作組分請在使用前10分鐘配置,并立即加入到微孔中
	樣本加入后未混勻	針對同時加入多種試劑組分,加樣后在混勻器上充分混勻,注意穩拿穩放,防止外濺
	酶標儀測定重復性差	校準酶標儀
	孵育時間、洗滌條件、顯色條件、操作人員不一致	重復測定標本,反應條件、人員等盡可能與上次保持一致
	洗滌不正確	移液器準確加入200μl/孔洗滌液或注滿各孔,但不要溢出.洗板機洗板時不應有堵孔,洗滌應充分
	孵育溫度恒溫效果不好	保持溫度恒定,避免局部溫度過高過低
	加液時,過多殘留于孔壁上	加液時,吸頭在不碰到孔底的前提下盡量沿著孔壁下方加液
	耗材重復使用	吸取不同的試劑時應更換吸頭,配置不同的試劑組分時,應使用不同的儲液器皿
	微孔底部被劃傷或者存在污垢	操作時細心,注意不要觸碰底部擦拭酶標板底部,以去除污垢或者指紋
	閾值附近時陰時陽	同一樣品做3個復孔,以2個(含2個以上相同結果為準)
	加樣時交叉污染	加標本時盡量避免交叉污染
出現隨機性的花板、跳孔現象	手工洗板造成的交叉污染	手工洗板時前3次注洗液后應立即棄去,后幾次再設定浸泡時間,可以減少交叉污染
	拍板時交叉污染	拍板時用合適的吸水紙巾,不要把無關物質拍進板孔,并盡量不要在同一位置拍,以免交叉污染
	洗板機加液頭堵塞導致加液不滿或吸液殘留量較大,造成花板、跳孔	疏通加液頭,使洗板時每孔均注滿洗液,吸液時殘留量要小
	樣本離心處理不全,致使反應孔內發生凝血現象或存在沉淀物或殘留細胞成分干擾	血清血漿應充分離心,3000rpm 6min以上
	樣品放置時間過長,污染	樣品應保持新鮮,或低溫保存,防止污染
	洗滌液配制有誤或直接誤用濃縮洗滌液	請按說明書配置